人教高中生物考点加强课5 基因表达载体构建中限制酶的选择原则.doc

限制酶选择的三大依据
1.根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
图1
(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择Pst Ⅰ(目的基因两端均具Pst Ⅰ)。
(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择SmaⅠ。
(2)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)，而且这种切点不至于完全破坏“标记基因”。
2.根据质粒的特点确定限制酶的种类
(1)所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
(2)质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有一个完好的标记基因，如图2中限制酶pstⅠ因其会破坏该质粒上唯一的标记基因而不宜选择。
(3)所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点(如图2中KpnⅠ)。如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段——若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
(4)所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图2中HindⅢ会破坏启动子，EcoRⅠ会破坏终止子，而Nde Ⅰ和BamHⅠ切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。
3.参照Ti质粒的T－DN***段选择限制酶
若质粒上标出T－DN***段，则所选限制酶切点应位于T－DN***段中，从而有利于将目的基因嵌入到T－DN***段上——因为Ti质粒的T－DN***段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上，从而实现“转化”。如用两种限制酶XbaⅠ和SacⅠ(两种酶切出的黏性末端不同)切割某DNA，获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达载体，则甲～丁四种Ti质粒中宜选择“丙”作载体，而不宜选择甲、乙、丁。(分析如下)
1.(2016·全国卷Ⅲ，40)图(a)中的三个DN***段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被　　　　酶切后的产物连接，理由是________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组DNA分子，如图(c)所示，这三种重组DNA分子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有　　　　，不能表达的原因是_______________________________
____________________________________________________________________。
图(c)
(3)DNA连接酶是将两个DN***段连接起来的酶，常见的有　　　　和　　　　，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_______________________________。
[慧眼识图　获取信息]
(1)三种限制酶切割结果分析
(2)基因表达载体分析
答案　(1)Sau3AⅠ　两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端　(2)甲、丙　甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录　(
3)E·coliDNA连接酶　T4DNA连接酶　T4DNA连接酶
2.(2016·经典高考)下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：
(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用　　　　两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过　　　　酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于　　　　态的大肠杆菌。
(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加　　　　，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中　　　　。
(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为　　　　，对于该部位，这两种酶　　　　(填“都能”、“都不能”或“只有一种能”)切开。
(4)若用Sau3AⅠ切图1质粒最多